誘導(dǎo)原理:
E.coli的乳糖操縱子（元）含Z、Y及A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙酰基轉(zhuǎn)移酶，此外還有一個(gè)操縱序列O、一個(gè)啟動(dòng)序列P及一個(gè)調(diào)節(jié) 基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白，后者與O序列結(jié)合，使操縱子（元）受阻遏而處于關(guān)閉狀態(tài)。在啟動(dòng)序列P上游還有一個(gè)分解（代謝）物基因激 活蛋白（CAP）結(jié)合位點(diǎn)。由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點(diǎn)共同構(gòu)成lac操縱子的調(diào)控區(qū)，三個(gè)酶的編碼基因即由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表達(dá) 。
在沒(méi)有乳糖存在時(shí)，lac操縱子（元）處于阻遏狀態(tài)。此時(shí)，I序列在PI啟動(dòng)序列操縱下表達(dá)的Lac阻遏蛋白與O序列結(jié)合，阻礙RNA聚合酶與P序列結(jié) 合，抑制轉(zhuǎn)錄起動(dòng)。當(dāng)有乳糖存在時(shí)，lac操縱子（元）即可被誘導(dǎo)。在這個(gè)操縱子（元）體系中，真正的誘導(dǎo)劑并非乳糖本身。乳糖進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)β-半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)楫惾樘恰：笳咦鳛橐环N誘導(dǎo)劑分子結(jié)合阻遏蛋白，使蛋白構(gòu)象變化，導(dǎo)致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉(zhuǎn)錄。異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的作用與異乳糖相同，是一 種作用*的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定，因此被實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。
實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備:
1、誘導(dǎo)表達(dá)材料：
( 1 ) LB (Luria—Bertani))培養(yǎng)基：
酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g
NaCl 10g 瓊脂 (Agar) 1-2%
蒸餾水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0
適用范圍：大腸桿菌
( 2 ) IPTG 貯備液：
2 g IPTG溶于10 mL 蒸餾水中,0 . 22 μm 濾膜過(guò)濾除菌,分裝成1 mL /份,-20 ℃ 保存.
( 3 ) l× 凝膠電泳加樣緩沖液：
50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )
50 mmol / L DTT
2 % SDS (電泳級(jí))
0.1 % 溴酚藍(lán)
10 % 甘油
2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白純化材料：
1 )酶溶法
(1)裂解緩沖液：
50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )
1 mmol / L EDTA
100 mmol / LNaCI
(2)50 mmol / L 苯j(luò)ia基磺酰氟(PMSF ).
(3)10 mg / mL 溶菌酶.
(4)脫氧膽酸.
(5)1 mg / mL DNase I.
2 )超聲破碎法
( 1 ) TE 緩沖液.
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝膠電泳加樣緩沖液：
100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )
100 mmol / L DTT
4 %SDS
0.2 % 溴酚藍(lán)
20 % 甘油
1、外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)：
(1)用適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切核酸酶消化載體DNA 和目的基因.
( 2 )按連接步驟連接目的基因和載體,并轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的宿主菌.
( 3 )篩選出含重組子的轉(zhuǎn)化菌落,提取質(zhì)粒DNA 作限制性?xún)?nèi)切核酸酶圖譜,DNA 序列測(cè)定,
確定無(wú)誤后進(jìn)行下一步.
( 4 )如果表達(dá)載體的原核啟動(dòng)子為PL 啟動(dòng)子,則在30 -32 ℃ 培養(yǎng)數(shù)小時(shí),使培養(yǎng)液的OD600達(dá)0.4-0.6 ,迅速使溫度升至42 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h ;如果表達(dá)載體的原核啟動(dòng)子為tac 等,則37 ℃培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)小時(shí)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后加IPTG 至終濃度為1 mmol / L.繼續(xù)培養(yǎng)3 -5h .
( 5 )取上述培養(yǎng)液1 mL , 1000g 離心,1 min ,沉淀,加100 μL 聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液后,作SDS -PAGE 檢測(cè).
2、大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質(zhì)純化：
細(xì)菌的裂解
常用方法有：① 高溫珠磨法;② 高壓勻漿;③ 超聲破碎法;④ 酶溶法;⑤ 化學(xué)滲透等.前三種方法屬機(jī)械破碎法,并且方法① 、② 已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用,后三種方法在實(shí)驗(yàn)室研究中應(yīng)用較為廣泛.下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實(shí)驗(yàn)步驟.
酶溶法.常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3 -葡聚糖酶;β-1,6 -葡聚糖酶;蛋白酶;殼多糖酶;糖昔酶等.溶菌酶主要對(duì)細(xì)菌類(lèi)有作用,而其他幾種酶對(duì)酵母作用顯著.主要步驟為：
4 ℃ ,5000rpm 離心,15 min ,收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌培養(yǎng)液(100 mL ).棄上清,約每克濕菌加3 mL 裂解緩沖液,懸浮沉淀.
