1、取5×TBE緩沖液20ml加水至200ml，配制成0.5×TBE稀釋緩沖液，待用。
2、膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖，置于200ml錐形瓶中，加入50ml 0.5×TBE稀釋緩沖液，放入微波爐里(或電爐上)加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖勻，此為0.8%瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。加熱時應蓋上封口膜，以減少水份蒸發。
3、膠板的制備：將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏(寬約1cm)緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持1mm左右的間隙。
向冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液使其終濃度為0.5μg /ml(也可不把EB加入凝膠中，而是電泳后再用0.5μg/ml的EB溶液浸泡染色)。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內側，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內，使膠液形成均勻的膠層。倒膠時的溫度不可太低，否則凝固不均勻，速度也不可太快，否則容易出現氣泡。待膠*凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內加入0.5×TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。因邊緣效應樣品槽附近會有一些隆起，阻礙緩沖液進入樣品槽中，所以要注意保證樣品槽中應注滿緩沖液。
4、加樣：取10μl酶解液與2μl 6×載樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換tip頭，以防止互相污染，注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。
5、電泳：加完樣后，合上電泳槽蓋，立即接通電源。控制電壓保持在60-80V，電流在40mA以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm時，停止電泳。
6、染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入0.5μg/ml的EB溶液中，室溫下染色20-25分鐘。
7、觀察和拍照：在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有EB的電泳膠板。DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時應戴上防護眼鏡或有機玻璃面罩，以免損傷眼睛。 經照相機鏡頭加上近攝鏡片和紅色濾光片后將相機固定于照相架上，采用全色膠片，光圈5.6，曝光時間10-120秒(根據熒光條帶的深淺選擇)。
8、DNA分子量標準曲線的制作：在放大的電泳照片上，以樣品槽為起點，用卡尺測量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的遷移距離，以厘米為單位。以核苷酸數的常用對數為縱坐標，以遷移距離為橫坐標，在坐標紙上繪出連結各點的平滑曲線，即為該電泳條件下DNA分子量的標準曲線。
9、DNA酶切片段大小的測定：在放大的電泳照片上，用卡尺量出DNA樣品各片段的遷移距離，根據此數值，在DNA分子量標準曲線上查出相應的對數值，進一步計算出各片段的分子量大小(若用單對數坐標紙來繪制標準曲線，則可根據遷移距離直接查出DNA片段的大小)。反之，若已知DNA片段的大小亦可由標準曲線上查出它預計的遷移距離。
10、DNA酶切片段排列順序的確定：根據單酶切，雙酶切和多酶切的電泳分析結果，對照DNA酶切片段大小的數據進行邏輯推理，然后確定各酶切片段的排列順序和各酶切位點的相對位置。以環狀圖或直線圖表示，即成該DNA分子的限制性內切酶圖譜。
