用CaCl2處理制備新鮮的大腸桿菌感受態細胞操作步驟
點擊次數：2257 更新時間：2018-08-28
1. 從37℃培養16~20 h 的新鮮平板中挑取一個單菌落（如大腸桿菌DH52），或1 ml 新鮮的16~20 h過夜培養物，轉到一個含有100ml LB培養基的1 L 或500 ml 培養瓶中。于37℃振搖培養約2~3 h（旋轉搖床200~300 r/min），每隔20~30 min測量OD600值≈0.4。
2. 在無菌條件下將細菌轉移到一個，用冰預冷的50 ml 聚丙烯離心管中，冰上放置10~20 min。
3. 于4℃4000轉 /分離心10 min，回收細菌細胞。
4. 將管倒置1 min，以使后殘留的痕量培養液流盡。
5. 以10 ml 用冰預冷的0.1 mM CaCl2重懸每份沉淀，放于冰上 ， 4℃4000轉 /分離心10 min，回收細菌細胞。
6. 每50 ml 初始培養物用2 ml 冰預冷的0.1 M CaCl2重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存備用。
7. 用無菌吸頭從感受態細胞懸液中取200 μl 轉移到無菌的微量離心管中，加DNA或連接反應混合物（體積≤10 μl，DNA≤50 ng），輕旋以混勻內容物，冰浴30 min。
8. 將離心管放到預加溫到42℃的水浴中，90 s。
9. 將混合物快速轉移到冰浴中，冷卻1~2分鐘，加入適當的培養基在37 ℃培養45 分鐘，使細胞復蘇，并表達質粒所攜帶的轉化基因。
10. 將適當體積（每個90 mm平板可達200 μl）已轉化的感受態細胞轉移到相應抗生素的平板培養基上。
11. 將平板置于室溫至液體被吸收 ，倒置平板于37℃培養箱中，12~16 h，平板培養，克隆在此期間應該出現，否則轉化不成功。
