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  • 上海遠慕生物科技有限公司

    微生物鑒定中常用的生化反應
    點擊次數:829 更新時間:2019-05-29

    試驗目的 血清分型

    標本 出血熱恢復期病人血清

    材料

    1、 毒株 漢灘病毒標準株 76-118,漢城病毒標準株 Seoul;

    2、標準血清 兔抗漢灘病毒、漢城病毒血清;

    3、空斑減少中和試驗常用試劑。

    步驟

    1、將待檢血清用牛血清Hanks 氏液稀釋成1:10,56℃滅活30分鐘;

    2、進一步2倍稀釋血清成1:20、1:40、1:80……,對照血清1:10稀釋;

    3、稀釋兩種病毒(在冰浴中進行)至含200pfu/ml;

    4、各連續稀釋度血清分別與200pfu/ml的兩種病毒液等量混合(各0.3ml),置37℃中作用1小時(每15分鐘振蕩一次);

    5、吸出各細胞培養孔中維持液;

    6、接種長滿單層的Vero-E6細胞(24孔板),每孔接種血清病毒混合液、標準血清對照及兩種病毒對照 ,每稀釋度兩孔,100ul/孔。37℃吸附1小時,每隔15分鐘搖動一次;

    7、加*層瓊脂糖覆蓋液(需冷置42℃左右),每孔1ml,室溫下待凝固,細胞面朝上,置37℃5%CO2孵箱培養7-9天;

    8、加第二層含中性紅瓊脂糖覆蓋液,1ml/孔,室溫下待凝固,細胞面朝上,置37℃5%CO2孵箱培養2-5天,從第二天開始觀察空斑數;

    9、抗體滴度的判定,以比病毒對照的空斑數中和或減少50%的血清zui高稀釋度倒數判為待檢血清中和抗體滴度;

    10、型別判定:根據同一份血清與兩種病毒的反應滴度不同來區分,如果一份血清與漢灘病毒 (或漢城病毒)反應的抗體滴度高于與漢城病毒(漢灘病毒)的抗體滴度4倍或以上,即判為漢灘病毒型,反之則為漢城病毒型。兩者滴度相差無幾時,則不好分型。不足4倍時亦不能定型。

    配方

    1、*層瓊脂糖覆蓋液

     

    2×Eagle MEM液50ml(Gibco-BRL)
    滅活胎牛血清10ml
    L-谷氨酰胺4ml(200mmol/L,100X)
    MEM非必需氨基酸1ml(Gibco,100x)
    1mol/L HEPES緩沖液2ml
    青鏈霉素1ml(青霉素10000u/ml,鏈霉素10000ug/ml)
    制霉菌素(一般可以不加)0.1ml
    臨用前配制,放入42℃水浴中,另取
    瓊脂糖0.6g(Sigma, Type II medium EEO)
    超純水34ml(適用于細胞培養的純化水)
    8磅高壓滅菌15min,置42℃水浴15min,加入上述配制的組分中,即可使用。

     

    2、第二層瓊脂糖覆蓋液 基本上同*層瓊脂糖覆蓋液,僅將滅活胎牛血清改為5ml,另加中性紅溶液1ml(333.0ug/L中性紅鈉鹽Gibco)。

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