<label id="3ldvz"></label>

<span id="3ldvz"></span>
<thead id="3ldvz"><optgroup id="3ldvz"></optgroup></thead>

  • <label id="3ldvz"><meter id="3ldvz"></meter></label>
    <span id="3ldvz"></span>
  • 上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司

    多年 CCK-8 經(jīng)驗(yàn)總結(jié)請收好,這些坑不要再跳了
    點(diǎn)擊次數(shù):1714 更新時(shí)間:2019-05-31

    在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)過程中,大家是不是總會好奇別人家的實(shí)驗(yàn)總是做的又快又好,而自己做的實(shí)驗(yàn)又慢又難得做出自己滿意的結(jié)果,搞得一天到晚也挺忙的,心想:我也很努力很認(rèn)真啊,為啥效率總提不起來呢?

    其實(shí),有時(shí)候并不是自己不努力,只是沒有找對方法。做實(shí)驗(yàn)可不能光是埋頭苦干,還要學(xué)會運(yùn)用合適的檢測試劑盒,這樣就能事半功倍。

    如果你還在用 MTT,那就真的 OUT 了,MTT 花 4 小時(shí)才能得到的結(jié)果用 CCK-8 只需 1 小時(shí),CCK-8 可用于細(xì)胞增殖和毒性分析,同 MTT 法相比,CCK-8 即開即用,檢測時(shí)間大概在 1 小時(shí)左右。

    不僅如此,CCK-8 對細(xì)胞的毒性極小,*可以測完細(xì)胞增殖或藥物毒性后再繼續(xù)用細(xì)胞進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)。下面小編就來為大家介紹一下 CCK-8 的具體情況。

    CCK-8 基本原理

    基本原理為:該試劑中含有 WST-8【化學(xué)名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2 H-四唑單鈉鹽】,它在電子載體 1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓*(1-Methoxy PMS)的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物(Formazan dye)。生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。

     

     

    圖 1. WST-8 檢測原理圖 EC=electron coupling reagent,即電子耦合試劑)

     

     

    圖 2. CCK-8 檢測細(xì)胞活性原理圖

    產(chǎn)品用途

    主要用于藥物篩選、細(xì)胞增殖測定、細(xì)胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗(yàn)。

    細(xì)胞毒性檢測的實(shí)驗(yàn)對比

    表 1. 細(xì)胞毒性檢測的實(shí)驗(yàn)對比

    CCK-8 的實(shí)驗(yàn)方法與步驟

    實(shí)驗(yàn)一:細(xì)胞活性檢測

    1. 收集對數(shù)期細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度,96 孔板每孔加入 100 μL, 使待測細(xì)胞調(diào)密度至 (1,000~10,000)/ 孔。

    2. 5% CO2,37℃ 培養(yǎng)細(xì)胞 24 小時(shí)(培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)細(xì)胞種類的不同和每孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的多少而異)。

    3. 每孔加入 10 μL CCK-8 溶液。如果起始的培養(yǎng)體積為 200 μL,則需加入 20 μL CCK-8 溶液,其它情況以此類推。

    4. 在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育 0.5~4 小時(shí),對于大多數(shù)情況孵育 1 小時(shí)就可以了。時(shí)間的長短根據(jù)細(xì)胞的類型和細(xì)胞的密度等實(shí)驗(yàn)情況而定(一般情況下,白細(xì)胞較難顯色,因此需要較長的 CCK-8 反應(yīng)時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量。懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難顯色。對于貼壁細(xì)胞,CCK-8 的培養(yǎng)時(shí)間一般為 1~4 小時(shí),注意:CCK-8 的jia反應(yīng)時(shí)間以具體顯色的jia時(shí)間為準(zhǔn))。初次實(shí)驗(yàn)時(shí)可以在 0.5、1、2 和 4 小時(shí)后分別用酶標(biāo)儀檢測,然后選取吸光度范圍比較適宜的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    5. 在 450 nm 測定吸光度。

    ☆ 實(shí)驗(yàn)二: 細(xì)胞增殖 - 毒性檢測

    1. 收集對數(shù)期細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度,96 孔板每孔加入 100 μL, 使待測細(xì)胞調(diào)密度至 (1,000~10,000)/ 孔。

    2. 5% CO2,37℃ 培養(yǎng)細(xì)胞 24 小時(shí)(培養(yǎng)時(shí)間根據(jù)細(xì)胞種類的不同和每孔內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的多少而異)。

    3. 加入 10 μL 不同濃度的待測物質(zhì),將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間 (例如 6、12、24 或 48 小時(shí))。

    4. 每孔加入 10 μL CCK-8 溶液。如果起始的培養(yǎng)體積為 200 μL,則需加入 20 μL CCK-8 溶液,其它情況以此類推。

    5. 在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育 0.5~4 小時(shí),對于大多數(shù)情況孵育 1 小時(shí)就可以了。時(shí)間的長短根據(jù)細(xì)胞的類型和細(xì)胞的密度等實(shí)驗(yàn)情況而定(一般情況下,白細(xì)胞較難顯色,因此需要較長的 CCK-8 反應(yīng)時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量。懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難顯色。對于貼壁細(xì)胞,CCK-8 的培養(yǎng)時(shí)間一般為 1~4 小時(shí),注意:CCK-8 的jia反應(yīng)時(shí)間以具體顯色的jia時(shí)間為準(zhǔn))。初次實(shí)驗(yàn)時(shí)可以在 0.5、1、2 和 4 小時(shí)后分別用酶標(biāo)儀檢測,然后選取吸光度范圍比較適宜的一個(gè)時(shí)間點(diǎn)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    6. 在 450 nm 測定吸光度。

    圖 3. 實(shí)驗(yàn)操作示意圖

    ☆ 注意事項(xiàng):

    如果待測物質(zhì)有氧化還原性,可在加 CCK-8 之前更換新鮮的培養(yǎng)基,去掉待測物質(zhì)的影響。

    ☆ 計(jì)算公式:

    • 細(xì)胞存活率 = [(實(shí)驗(yàn)孔 — 空白孔)/ (對照孔 — 空白孔)] × 100%

    • 抑制率 = [(對照孔 — 實(shí)驗(yàn)孔) / (對照孔 — 空白孔)] × 100%

    • 實(shí)驗(yàn)孔 (含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、待測物質(zhì))

    • 對照孔 (含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、沒有待測物質(zhì))

    • 空白孔 (不含細(xì)胞和待測物質(zhì)的培養(yǎng)基、CCK-8) 

    注意事項(xiàng)

    1. 次做實(shí)驗(yàn)時(shí),建議先做幾個(gè)孔摸索接種細(xì)胞的數(shù)量和加入 CCK-8 試劑后的培養(yǎng)時(shí)間。

    2. 接種時(shí)注意細(xì)胞懸液一定要混勻,以避免細(xì)胞沉淀下來,導(dǎo)致每孔中的細(xì)胞數(shù)量不一致。

    3. 培養(yǎng)板周圍一圈孔培養(yǎng)液容易揮發(fā),為減少誤差,建議培養(yǎng)板周圍的四邊每孔只加培養(yǎng)基。

    4. 建議采用多通道移液器,減少平行孔間的誤差,加 CCK-8 時(shí),建議斜貼著培養(yǎng)板壁加,不要插到培養(yǎng)基液面下加,容易產(chǎn)生氣泡,干擾 OD 值。

    5. 若細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長,培養(yǎng)基顏色或 pH 發(fā)生變化,建議更換培養(yǎng)基后再加 CCK-8,含有酚紅的培養(yǎng)基不影響測定。

    6. CCK-8 對細(xì)胞的毒性非常低,其他的實(shí)驗(yàn),例如中性紅法或結(jié)晶紫法 ,也可在 CCK-8 法檢測完后繼續(xù)進(jìn)行。

    7. 可以使用大于 600 nm 的波長,例如 650 nm,作為參考波長進(jìn)行雙波長測定,CCK-8 在參比波長處沒有吸光值,設(shè)定參比波長的目的是為了去除由于樣品渾濁所帶來的吸收。

    8. 如果實(shí)驗(yàn)中待測物質(zhì)有氧化還原劑,在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入藥物,然后加入 CCK-8 試劑在一定時(shí)間內(nèi)檢測,和不加藥物的培養(yǎng)基進(jìn)行比較 (只加 CCK-8 試劑),如果 OD 值明顯偏高,則說明有反應(yīng)。

    9. 加 CCK-8 試劑時(shí)速度要快,減少試劑在移液器上的殘留,加入 CCK-8 試劑后輕輕震培養(yǎng)板,為了避免加樣時(shí)由于 CCK-8 殘留在槍頭上所帶來的誤差,可以在加樣前用培養(yǎng)稀釋 CCK-8 試劑并混勻后加樣。

    10. CCK-8 反復(fù)凍融會增加背景值,干擾實(shí)驗(yàn)測定。

    CCK-8 常見問題解答

    ☆ CCK 的保存和穩(wěn)定性如何?

    答:CCK 穩(wěn)定性高,避光條件 -20℃ 有效期 2 年,4℃ 有效期 1 年。經(jīng)常使用建議 4℃ 保存,避免反復(fù)凍融。CCK 正常顏色為粉紅色,若顏色發(fā)生明顯偏差,質(zhì)量可能有發(fā)生變化。

    ☆ CCK 會對活細(xì)胞進(jìn)行染色嗎?

    答:不會,首先 WST-8 不會進(jìn)入細(xì)胞染色,整個(gè)顯色反應(yīng)都是在培養(yǎng)體系中進(jìn)行的。另外 WST 和 WST-8 甲臜都屬于高度水溶性組分,反應(yīng)結(jié)束更換新的培養(yǎng)液,即可清除外源組分。

    在加入 CCK-8 時(shí)可否不更換培養(yǎng)基?

    答:一般情況下可以不更換培養(yǎng)基。但是如果培養(yǎng)基里有氧化還原性物質(zhì)的話,有可能會產(chǎn)生誤差,必須更換其它培養(yǎng)基。

    ☆ 若是使用 6 孔或者 24 孔板進(jìn)行試驗(yàn),CCK 試劑使用量怎么樣呢?

    答:如果要使用 6 孔板或 24 孔板實(shí)驗(yàn),請先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量,并按照每孔培養(yǎng)基總體積的 10% 加入 CCK 溶液。

    ☆ 能否用 384 孔板進(jìn)行細(xì)胞增殖與活性檢測的實(shí)驗(yàn)?zāi)兀?/strong>

    答:可以,CCK-8 產(chǎn)品的使用量為每孔培養(yǎng)基總體積的 10%。建議先將 CCK-8 產(chǎn)品稀釋一倍,然后加入培養(yǎng)基總體積的 20% 即可,這樣可減少誤差。

    ☆ 只可以在 450 nm 波長處測 OD 值嗎?

    答:可以在 450 nm 波長處測 OD 值,但是若無此波長的濾光片,可選擇吸光度在 430~490 nm 之間的濾光片,但是 450 nm 濾光片的檢測靈敏度高。

    ☆ 若是暫不檢測 OD 值,該如何處理?

    答:若暫時(shí)不測定 OD 值,可以向每孔中加入 10μL0.1 M 的 HCl 溶液或者 1% w/v SDS 溶液,并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24 小時(shí)內(nèi)測定,吸光度不會發(fā)生變化

    ☆ 在實(shí)驗(yàn)中 OD 值太高,怎么解決?

    答:可以縮短加入 CCK-8 后的培養(yǎng)時(shí)間。例如:可以把加入 CCK-8 試劑后的培養(yǎng)時(shí)間由 2 小時(shí)縮短為 1 小時(shí)。此外,可適當(dāng)減少細(xì)胞的數(shù)量。

    ☆ 如果 OD 值太低,怎么解決?

    答:可以采取 2 個(gè)辦法:1、適當(dāng)增加細(xì)胞數(shù)量;2、延長加入 CCK-8 試劑后的反應(yīng)時(shí)間。

    ☆ 應(yīng)該每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎?

    答:建議每次做。雖然細(xì)胞是一樣的,但是細(xì)胞的狀態(tài)不一定一樣。對于狀態(tài)不一樣的細(xì)胞,建議每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司 版權(quán)所有 地址:上海市嘉定區(qū)曹安公路5588號 郵編:201202 電話: 管理登陸
    傳真:021-58999639 手機(jī):13310162040 聯(lián)系人:俞燕熙 郵箱:m13310162040@163.com  GoogleSitemap 網(wǎng)址:m.ylcdjx.com ICP備案號:滬ICP備14029423號-1
    主營:ELISA試劑盒/染色液/溶液 /動物血清/標(biāo)準(zhǔn)品/化學(xué)試劑
    點(diǎn)擊這里給我發(fā)消息
    手機(jī):13310162040
    主站蜘蛛池模板: 亚洲狠狠婷婷综合久久久久| 国产精品亚洲不卡一区二区三区| 亚洲av永久无码精品国产精品| 免费在线人人电影网| 精品剧情v国产在免费线观看| 亚洲日本成本人观看| 在线视频免费观看www动漫| 无码专区一va亚洲v专区在线| 亚洲精品无码中文久久字幕| 免费看又爽又黄禁片视频1000| 亚洲欧洲免费无码| 最好免费观看韩国+日本| 亚洲国产电影av在线网址| 国产精品亚洲а∨无码播放麻豆 | free哆啪啪免费永久| 亚洲精品国产成人| 毛片a级毛片免费观看品善网| 亚洲精品你懂的在线观看| 男女作爱在线播放免费网站| 久久国产亚洲高清观看| 色婷婷综合缴情综免费观看| 91免费国产在线观看| 亚洲中文字幕一二三四区苍井空| 大学生一级特黄的免费大片视频| 国产精品亚洲专区无码牛牛| 三年片在线观看免费观看大全一| 91亚洲国产成人精品下载| 国产美女在线精品免费观看| 久久精品国产亚洲精品2020| 皇色在线视频免费网站| 亚洲av无码乱码国产精品fc2| 亚洲免费在线视频观看| 国产亚洲精品免费| 久久精品国产精品亚洲艾| 国产免费av片在线看| 国产免费内射又粗又爽密桃视频| 久久久久久亚洲Av无码精品专口| 免费看片A级毛片免费看| 免费无码作爱视频| 久久亚洲2019中文字幕| 99久久国产热无码精品免费|