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  • 上海遠慕生物科技有限公司

    原代細胞復蘇和傳代流程詳述
    點擊次數:858 更新時間:2019-08-08

    一、實驗前準備工作:
     

    1、培養瓶的包被:包被液如多聚賴氨酸(PLL,ScienCell品牌,貨號0403或0413)纖維粘連蛋白(BPF,ScienCell品牌,貨號8248),以無菌水稀釋至2 ug/cm2的濃度包被培養瓶。37度孵箱1小時或4度過夜,從包被好的培養瓶中回收多聚賴氨酸,并用無菌水洗滌培養瓶2遍。包被好的培養瓶不要放置超過24小時,其中的包被液可吸出重復使用2-3次,注意不要污染。


    2、*培養基的配置:以內皮細胞培養基(ECM,ScienCell品牌,貨號1001)為例,把配套的胎牛血清(FBS,ScienCell品牌,貨號0025)生長因子(ECGS,ScienCell品牌,貨號1052)和雙抗(P/S,ScienCell品牌,貨號0503)加入基礎培養液(ECM,ScienCell品牌,貨號1001)中。重新貼好標簽,并混勻培養基。

    二、原代細胞復蘇方法:
    1、從液氮中取出原代細胞冷凍管,迅速投入37~38 ℃水浴中,其間可以輕輕轉動細胞,加快融化速度,大約需要1分鐘時間。
    2、5分鐘內用培養基稀釋至原體積的10倍以上,加入培養瓶中,再用1ml培養基洗滌細胞凍存管,保證細胞都被加入培養瓶中,靜置于孵箱,12-16小時后更換培養基(除去DMSO)。以后每2天換一次液,保證細胞狀態良好。

    三、原代細胞傳代方法:酶消化法
    當細胞生長至70-80%左右可以傳代,傳代比例以1:2或1:3為佳。具體方法如下:
    1、棄去培養瓶中培養基,用PBS洗滌培養瓶2遍,加入0.25%的胰酶消化液(Trypsin-EDTA,ScienCell品牌,貨號0103),以消化液能覆蓋整個瓶底為準。37度孵育4分鐘左右,輕拍培養瓶側面,顯微鏡下觀察細胞消化情況,直到80%細胞呈現圓形。
    2、細胞消化好后,加入胰酶中和液(TNS,ScienCell品牌,貨號0113),并輕輕搖動培養瓶,形成細胞懸液,然后將細胞和培養基轉移至離心管中,1000rpm離心5分鐘。
     

    3、棄去上清液,以1-2ml新鮮培養基重新懸浮細胞并吹打均勻,接種于包被好的新培養瓶中,瓶中已有10ml左右的培養基,放入培養箱中培養,每2天更換培養基。


     

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