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  • 上海遠慕生物科技有限公司

    簡述膜再生液的配制方法及注意事項
    點擊次數:9982 更新時間:2019-09-26

    膜再生液可在不影響抗原蛋白的情況下清除膜上結合的抗體。隨后,可以使用不同的抗體進行下一輪Western Blot實驗。一般stripping的原理都是利用蛋白變性以及利用beta-mercaptoethanol打開-s-s-,使一抗二抗解聚變性而被洗去,但洗脫的強度是一個關鍵,小了抗體洗不干凈影響re-probe,大了又造成抗原的損失。

    膜再生液的配制:

    方法一:需要50℃溫浴)

    Stripping Buffer:β-mercaptoethanol 342 μl;20% SDS 5 ml;1MTris-Cl pH 6.7 3.125 ml;加ddH2O至50 ml。

    方法:將用過的膜浸入stripping buffer中,置50℃水浴箱中30min,間斷振搖。之后用TTBS洗5min/次洗到無beta-mercaptoethanol的味道就好。此時你已經可以按新的轉移好的膜來再次使用了。

    方法二:(僅適用PVDF,但這種方法抗原損失少,抗體洗脫也比較干凈,我們比較過后也一直在使用)

    Stripping Buffer:50mM Glycine-NaOH(pH10.8), 7M Guanidine hydrochloride, 100mM KCl, 0.2mM EDTA, add 22.5uL beta-Mercaptoethanol/10mL stripping buffer just before use.

    1) After ECL development, wash membrane once for 10min with TBST/PBST.

    2) Incubate the membrane in stripping buffer in a shake for 6-8min at RT.

    3) Washed stripped membrane at least 3x for 8min each with TBST/PBST, then re-block.

    這種方法stripping buffer可以重復利用2次,用時也較快,當然基于鹽酸胍的配方還有很多,附件中也附一篇使用鹽酸胍的文章,文中也比較了幾種stripping方法,希望對lz有幫助;

    方法三:(實際上此法沒有洗去一二抗,但此法是理論上抗原無損失的)

    也在附件中附上原文,原理就和IHC中封閉內源過氧化物酶的道理是一樣的。

    膜再生液的注意事項:

    1. 膜再生液實質是在不影響膜上結合的抗原的條件下將抗體洗脫下來, 實際操作中, 膜類型、 抗體類型、濃度及抗原特性都影響洗脫難易度。

    2. 適用于 ECL 和類似的化學發光試劑進行的 Western 檢測。不適用于非化學發光試劑進行的 Western檢測,例如 DAB,NBT/BCIP。

    3. 用 ECL 顯色后,再生液洗脫幾分鐘后,可再次加入 ECL 顯色液顯影,如膠片上顯示條帶,表明抗體未除凈,須進一步在再生液中浸泡,至膠片上無顯色。

    4. 使用脫脂奶粉封閉的膜要比使用 BSA 封閉的膜更容易再生。

    5. 盡量避免讓膜干燥。

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