PCR 是一個坑，坑里埋了好多研究僧……
PCR 是眾位「研究僧」日常實驗中常用的技術，可謂是「研究盛宴」中的一道「小菜」。可也有不少童鞋反映，這道菜不hao吃，一不小心就「小河里翻船」。
那么，我們該如何把這道菜「吃好」、跳出這個「坑」呢？
諸位看官莫急，待我送君「三大fa寶」。
一、確保 RNA 樣本合格
常見的 RNA 提取方法有 TRIzol 法、吸附法，這兩個方法各有所長，但都不能保證提取的 RNA 樣本一定合格。
因而，提取完成后應測定 RNA 的濃度及吸光度。通常，在 260，280，230 nm 處分別測定其吸光度（A260、A280、A230）并計算其比值（A260 /A280，A260 /A230）。
那么，這幾個數值及其比值分別有何意義？
A260 為核酸的吸光度，A280 為蛋白質的吸光度，A230 為其他雜質（多糖等）的吸光度。純 DNA 的 A260 /A280 為 1.8，純 RNA 的 A260 /A280 為 2.0。
如果 OD 比值不在范圍內該如何解決呢？
再次洗滌樣本！
75% 乙醇沉淀 RNA 后重新吸附、洗滌；若采用 TRIzol 法提取 RNA，可直接洗滌兩次。洗滌后離心時可兩次分別將 EP 管置于不同的方向，便于*洗滌 RNA 樣本。通常洗滌兩次后可使測得的 OD 值較為理想。
二、 利用「RNAstructure」軟件
引物，是進行熒光定量實驗的*條件。其特異性的問題可通過「BLAST」搞定，讓人比較頭痛的是引物可以形成「發夾結構」或「二聚體」（即在＜75℃ 時出現溶解曲線的峰），影響擴增效率，終導致實驗結果不可用。
那么，這個問題能否解決呢？
有！設計引物的時候用「RNAstructure」預測一下引物的二級結構即可。
那么，這個軟件要如何使用呢？
1. 打開「RNAstructure」，單擊左上角的「new sequence」按鈕：
2. 新建序列文件，會出現一個對話框，輸入待檢測的引物序列：
3. 單擊「Fold as DNA」，「save changes」，出現新的對話框后直接點擊「Start」：
4. 無需更改其他參數，再次點擊「Draw structure」，即可得到目標序列的二級結構：
若考察引物能否形成發夾結構，則直接檢測 Forward 或 Reverse 引物即可。
若考察引物能否形成二聚體，則把兩條引物一起輸入，視作一條序列進行檢測即可。
在得到二級結構圖后，只要沒有連續 4 個以上的配對即可；若一條引物長度為 20 bp，在 18～22 處有連續 5 個的堿基配對，則可「手動拆解配對」，即保證引物為兩條鏈時的配對不多于 4 個即可。
三、保證擴增效率符合要求
有童鞋反映，兩個同類基因測試同一批樣本，理論上趨勢應該一致，結果卻是兩種趨勢，應該相信哪個呢？
不知道各位看官有沒有遇到類似的問題？這類問題該如何解決呢？
先說說出現這類問題的原因吧：
1. 擴增條件非*；
2. 樣本中含有抑制擴增的物質，如乙醇。
一對引物有其特定的 Tm 值，但 Tm 值時未必是其*擴增溫度。溫度過高時，擴增效率過低，差異部分的目的基因不能被擴增，導致「假陰性」結果的出現。
那么，如何確定擴增效率是否滿足要求呢？
通常，拿到新引物后應從 Tm- 5℃ 尋找其適宜的擴增溫度，在某溫度起為特異性擴增。
然后，在特異性擴增的溫度下檢測擴增效率：將 cDNA 梯度稀釋（一般為 2×），測試稀釋后的樣本 Ct 值差異是否為 1 左右。
若差值為 1，則擴增效率良好，可進行正式實驗。
若在特異性擴增的溫度范圍內不能使 Ct 值差異為 1，則需考慮重新設計引物。
