不同的化學消毒劑其作用原理也不*相同，大致歸納為三個面。一種化學消毒劑對細菌的影響常以其中一方面為主，兼有其他方面的作用。
（1）改變細胞膜通透性 表面活性劑（Surface-active agent）、酚類及醇類可導致胞漿膜結構紊亂并干擾其正常功能。使小分子代謝物質溢出胞外，影響細胞傳遞活性和能量代謝。甚至引起細胞破裂。
（2）蛋白變性或凝固酸、堿和醇類等有機溶劑可改變蛋白構型而攏亂多肽鏈的折疊方式，造成蛋白變性。如乙醇、大多數重金屬鹽、氧化劑、醛類、染料和酸堿等。
（3）改變蛋白與核酸功能基團的因子作用于細菌胞內酶的功能基（如SH基）而改變或抑制其活性。如某些氧化劑和重金屬鹽類能與細菌的-SH基結合并使之失去活性。
3．影響消毒劑作用的因素
（1）消毒劑的性質、濃度與作用時間各種消毒劑的理化性質不同，對微生物的作用大小也差異。例如表面活性劑對革蘭氏陽性菌的滅菌效果比對革蘭氏陰性菌好，龍膽紫對葡萄球菌的效果特別強。
同一種消毒劑的濃度不同，其消毒效果也不一樣。大多數消毒劑在高濃度時起殺菌作用，低濃度時則只有抑菌作用。在一定濃度下，消毒劑對某種細菌的作用時間越長，其效果也越強。若溫度升高，則化學物質的活化分子增多，分子運動速度增加使化學反應加速，消毒所需要的時間可以縮短。
（2）微生物的污染程度微生物污染程度越嚴重，消毒就越困難，因為微生物彼此重疊，加強了機械保護作用。所以在處理污染嚴重的物品時，必須加大消毒劑濃度，或延長消毒作用的時間。
（3）微生物的種類和生活狀態不同的細菌對消毒劑的抵抗力不同，細菌芽胞的抵抗力*，幼齡菌比老齡菌敏感。
（4）環境因素當細菌和有機物特別是蛋白質混在一起時，某些消毒劑的殺菌效果可受到明顯影響。因此在消毒皮膚及器械前應先清潔再消毒。
（5）溫度、濕度、酸堿度消毒速度一般隨溫度的升高而加快，所以溫度越高消毒效果越好。濕度對許多氣體消毒劑有影響。酸堿度的變化可影響劑殺滅微生物的作用。例如，季胺鹽類化合物的戊二醛藥物在堿性環境中殺滅微生物效果較好；酚類和次氯酸鹽藥劑則在酸性條件下殺滅微生物的作用較強。
（6）化學拮抗物陰離子表面活性劑可降低季胺鹽類和洗比泰的消毒作用，因此不能將新潔爾滅等消毒劑與肥皂、陰離子洗滌劑合用。次氯酸鹽和過氧乙酸會被硫代硫酸鈉中和，金屬離子的存在對消毒效果也有一定影響，可降低或增加消毒作用。
