實驗天天做，蛋白還是表達不好？
點擊次數(shù)：582 更新時間：2021-11-19
哺乳動物表達系統(tǒng)克服了原核表達系統(tǒng)翻譯后修飾蛋白表達的問題。表達的蛋白具備折疊和修飾的功能，高度人源化，可以用于結(jié)構(gòu)、功能分析。利用哺乳動物細胞表達蛋白通常有兩種方式：瞬時表達與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(構(gòu)建穩(wěn)定細胞系)。利用細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染將外源基因轉(zhuǎn)染至細胞染色體上，能夠長期穩(wěn)定地生產(chǎn)目的蛋白。但是實驗成本高、周期長、操作難度大。
瞬時蛋白表達是指外源基因存在于游離的載體上，并沒有轉(zhuǎn)染到細胞的染色體。構(gòu)建好質(zhì)粒后，經(jīng)過細胞復(fù)蘇、轉(zhuǎn)染、細胞培養(yǎng)、蛋白純化等步驟即可得到目的蛋白。操作簡單，實驗成本低，周期短，最shi合應(yīng)用于快速、小規(guī)模制備一定量的重組蛋白和重組抗體。
快來看看如何提高瞬時蛋白表達吧！
策略一 ：優(yōu)化編碼序列
根據(jù)特定的下游應(yīng)用設(shè)計最佳的編碼序列并選擇最合適的表達載體。在開始蛋白表達之前，使用密碼子優(yōu)化算法 (如OptimumGene?或GenSmart Codon Optimization) 以及表達載體選擇指南 (如金斯瑞的GenSmart? Design工具) 可節(jié)省時間、精力和費用。你知道嗎？金斯瑞可提供從基因合成(免費的密碼子優(yōu)化)到蛋白表達、純化等一體化服務(wù)！
策略二：提高蛋白溶解度
較低的蛋白質(zhì)溶解度是造成重組蛋白表達產(chǎn)量低的一個關(guān)鍵因素。我們建議首先調(diào)整一些常用的表達條件參數(shù)來提高蛋白質(zhì)的溶解度。
溫度
對于HEK293和其它哺乳動物細胞系，建議在37°C、5% CO2孵箱中培養(yǎng)細胞。有些研究表明，在轉(zhuǎn)染后24小時將溫度從37°C降至33°C培養(yǎng)，可提高HEK293細胞的蛋白表達。
盡管不同供應(yīng)商提供的基礎(chǔ)培養(yǎng)基十分類似，但它們之間的微小差異可能會影響特定表達細胞系的生長。一定要優(yōu)化外部成分的濃度、pH值、類型甚至是批次或批號，如添加到培養(yǎng)基中的血清。
培養(yǎng)基
培養(yǎng)基添加劑
在某些情況下，我們建議向培養(yǎng)基中添加特定的試劑來提升蛋白表達。例如添加組蛋白脫乙酰基酶抑制劑，使染色質(zhì)解聚并增加整合基因的轉(zhuǎn)錄活性。或者，向培養(yǎng)基中加入特定的生長因子有助于提高蛋白產(chǎn)量。
策略三：使用融合伴侶
蛋白標簽是插入到重組蛋白上的短肽序列，可以用于提高蛋白表達。通常會在蛋白表達結(jié)束時采用酶切或化學(xué)試劑去除。表1列舉了常用的蛋白標簽類型及其優(yōu)缺點。
表1：常用標簽列表
針對特定表達系統(tǒng)選擇合適的標簽取決于多種因素。如果目標是獲得*的產(chǎn)量，則需要使用助溶標簽，比如GST有很強的翻譯起始信號，能促進高水平的表達。但是，如果需要較低的表達水平，建議使用更嚴格的表位標簽，如His標簽。
策略四：優(yōu)化純化方法
根據(jù)下游應(yīng)用和純度要求設(shè)計不同的純化方法。如果蛋白表達量高，那么使用一步式親和純化方法就能獲得足夠量和純度的蛋白，滿足各種下游應(yīng)用。如果需要進一步純化，親和純化后通常可以進行分子排阻色譜(Size Exclusion Chromatography, SEC)。如需更進一步純化，則可使用離子交換色譜 (Ion Exchange, IEX) 。
