瓊脂擴散試驗包括瓊脂雙向單擴散試驗和瓊脂雙向雙擴散試驗，后者是最/常用的瓊脂擴散試驗，一般用于抗體或抗原的定性檢測，其原理是可溶性抗原與相應的抗體（抗血清）在瓊脂凝膠中向四周自由擴散，如果抗原和抗體相對應，則在二者比例適當處形成肉眼可見的白色沉淀線，反之則不會出現沉淀線。常用已知抗原檢測未知的血清樣本，也可用已知抗血清檢測未知抗原樣本。
1 瓊脂擴散試驗的影響因素
1.1 瓊脂板的制備
瓊脂板的質量、濃度、黏度、厚度、濕度等都會影響瓊脂擴散試驗的結果，瓊脂濃度越低，則孔徑越大，擴散速度也會越快；如果瓊脂濃度越大，那么瓊脂的黏度也會隨之增大，擴散速度會相對減慢，建議使用較好的瓊脂（瓊脂糖），最適濃度為1%，厚度約2.5毫米，注意倒熱融化瓊脂液時不要產生氣泡，而且空氣中的濕度很低，瓊脂中的水分容易蒸發，待瓊脂冷凝后加蓋，把平皿倒置，放在裝有濕紗布的搪瓷盤中，防止水分蒸發，保證濕度。
1.2 打孔
打孔是瓊脂擴散試驗中的關鍵，反應孔應現用現打，放在4℃冰箱中過夜后再使用。實驗室常用梅花打孔器，然后用針頭挑出內容物。用此種方法在打孔的過程中，注意挑出空內容物時避免將凝膠劃破，否則可造成孔與孔之間產生裂痕，產生錯誤的實驗結果。如果試驗檢測的樣品數量不是很多，還可以將若干梅花打孔器先放在空平皿中，孔口朝下，向平皿中倒入稍冷卻的熱融化瓊脂液，之后迅速并平穩地放入4℃冰箱中，冷卻后取出平皿，逐個輕輕拔出打孔器，根據實驗需要重復此操作。打孔后用酒精燈輕烤平皿底部進行封底時，在酒精燈上來回幾次，以平皿不燙手（微熱即可）為宜，若是塑料平皿要注意烤的時間不要過長，以免變形，待瓊脂剛剛融化為止，防止瓊脂板與平皿底部脫離導致陽性血清、被檢血清及抗原相互串通，避免出現模糊的沉淀環，影響實驗結果。
1.3 加樣
在加樣之前，首先在瓊脂板上標記好實驗日期及樣品編號，加樣過程中小心謹慎，每個樣品加完后都要換槍頭，避免產生小氣泡，需要注意的是每孔會因受人工操作的影響在封底時各孔的容積不同，在加樣時注意不要讓樣品溢出導致液體混合。如果大批量檢測樣品，必須將被檢血清、陽性血清和抗原先后加入一個梅花孔后再加入下一個梅花孔，防止加入的時間間隔太長而擴散的時間不同進而影響抗原抗體結合及沉淀線的產生。
1.4 判定結果
當標準陽性血清和抗原孔之間只有一條明顯致密線時，被檢血清與抗原孔形成沉淀線，或陽性血清的沉淀線向相鄰的被檢血清的抗原側偏彎，則被檢血清為陽性。如果被檢血清沒有出現任何沉淀帶，或出現的沉淀帶與陽性對照沉淀帶*交叉者判為陰性。觀察時需借助強光源，調整角度、方位直到陽性血清和抗原孔之間出現清晰白色沉淀線則試驗成立，否則應重做。
2 注意事項
2.1 溫度
溫度對整個試驗也會有影響，制備瓊脂板時融化瓊脂時需在水浴中進行，注意防止在加熱過程中由于水分的蒸發而影響溶液的濃度，在瓊脂中加入0.01%的硫柳汞防止細菌污染，避免腐/敗。在一定條件下，溫度越高擴散越快，通常反應在0～37℃下進行，在試驗中為保證沉淀線清晰度防止沉淀線變形，可在37℃下形成沉淀線，然后置于4℃條件下。
2.2 時間
擴散時注意時間，時間過短不能出現沉淀線，時間太長會導致沉淀線解離或散開出現假陰性而影響實驗結果，沉淀線的形成一般在24小時、48小時、72小時觀察并記錄，過久會出現沉淀線消失。
2.3 其他因素
不規則的沉淀線可能是加樣過滿溢出、打孔時孔型不規則、邊緣開裂、孔底滲漏、抗原抗體濃度不同、孵育時平皿未放平等等，所以在做瓊脂擴散試驗時一定要設立對照，以免出現假陽性。
