微生物樣品的掃描電鏡觀察廣泛地應(yīng)用于微生物學(xué)研究的各領(lǐng)域。為微生物資源的利用,微生物生物技術(shù)、遺傳工程、環(huán)境保護(hù)等提供了大量直觀的,有科研價(jià)值的形態(tài)學(xué)依據(jù)。 大多數(shù)微生物樣品體積微小,使樣品制備,尤其是臨界點(diǎn)干燥,離子濺射等難于操作。積多年微生物制樣的經(jīng)驗(yàn),遠(yuǎn)慕為大家介紹微生物中有代表性的細(xì)菌,霉菌的制樣技術(shù),其他微生物樣品均可參照處理。
1、細(xì)菌
取液體或固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)20h左右、旺盛生長(zhǎng)的菌體。
(1)收集菌體:?液體培養(yǎng)基中的菌體,可取培養(yǎng)液8000rpm離心3~5min,棄上清,倒入215%戊二醛固定液;?固體培養(yǎng)基上的菌體,可在菌落表面滴幾滴戊二醛固定液,輕刮菌落(注意不要刮下培養(yǎng)基)。將菌液吸入小離心管,離心后換入新鮮戊二醛固定。
(2)固定,脫水按常規(guī)方法。215%戊二醛,2~4hy磷酸緩沖液清洗3次y1%鋨酸4~6hy緩沖液清洗3次y乙醇梯度脫水,30%,50%,70%,85%,95%各一次,100%乙醇2次,15~20minP次y乙酸異戊酯置換2次,20minP次(注意:每步均需離心,8000rpm,3~5min,棄上清,倒入下一種試劑,滴管來(lái)回吸幾下,打散菌塊)。
(3)臨界點(diǎn)干燥:普通定性濾紙裁成35mm@18mm的紙條,將長(zhǎng)邊 35mm平均分成3份,對(duì)折成小紙包,用訂書(shū)釘將一端訂牢,成小口袋狀。將離心濃縮后的菌液滴入小紙包,立即用釘書(shū)器將另一端釘牢。放入臨界點(diǎn)干燥器樣品室,進(jìn)行CO2臨界點(diǎn)干燥。一般每次可同時(shí)處理10~20種不同菌樣(注意,需用液態(tài)CO2置換2~3次)。
(4)離子濺射金:沿兩端書(shū)釘剪開(kāi)濾紙包,將干燥后粉末狀純菌體倒入平皿,輕搖盡量分散菌體。碳導(dǎo)電膠帶一面粘在1P4蓋玻片上,另一面倒扣輕壓在菌體粉末上,翻正后用鑷子或牙簽將菌體輕輕刮薄鋪平。離子濺射金后,即可進(jìn)行掃描電鏡觀察。
2、霉菌
取在固體培養(yǎng)基上旺盛生長(zhǎng)的曲霉菌落。
(1)取材:在菌落四周用刀片劃5mm@5mm見(jiàn)方小塊。用刀片將小塊挑出,片成2mm厚的薄片。材料投入裝有戊二醛固定液的青/霉素小瓶(因菌塊易漂浮,用注射器從橡膠瓶塞刺入,抽出空氣,使樣塊沉下)。
(2)固定,脫水,臨界點(diǎn)干燥,離子濺射金參照組織塊制樣常規(guī)方法。
