微生物的檢驗(yàn)工作對(duì)環(huán)境有特殊的要求。潔凈環(huán)境是微生物檢驗(yàn)工作中必須的環(huán)境基礎(chǔ)。微生物檢驗(yàn)工作所處的無(wú)菌室必須注意定期消毒。避免檢測(cè)物受到污染。今天咱們就聊一聊微生物檢驗(yàn)中的無(wú)菌操作技術(shù)。
無(wú)菌室的工作要盡可能減少交流。不允許在無(wú)菌室內(nèi)談笑。要盡可能減少在無(wú)菌室內(nèi)走動(dòng)。沉降菌技術(shù)必須按照規(guī)定的時(shí)間進(jìn)行使用。工作人員進(jìn)入無(wú)菌室工作之前必須做好前期準(zhǔn)備工作。
要按照規(guī)定穿戴經(jīng)過(guò)特殊處理的服裝、并對(duì)身體做好清潔、避免對(duì)檢測(cè)品造成污染。在檢測(cè)樣品的提取過(guò)程中，工作人員要盡可能遠(yuǎn)離檢測(cè)物品。避免檢測(cè)物品受到細(xì)菌污染。檢測(cè)樣品提取之后要進(jìn)行科學(xué)的保存，避免受到污染。提取過(guò)程要盡可能加快速度，不能將檢測(cè)樣品在空氣中閑置太長(zhǎng)的時(shí)間避免空氣中的細(xì)菌對(duì)檢測(cè)樣品造成污染。
檢測(cè)樣品的提取過(guò)程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作的程序。打開(kāi)儲(chǔ)存樣品的時(shí)候，要使用濃度為75%的酒精對(duì)存在檢測(cè)樣品的器皿瓶口進(jìn)行消毒，要使用酒精棉球作為消毒的重要工具。器皿的瓶口要進(jìn)行兩次以上的酒精消毒，提取工作完成之后要科學(xué)的安放檢測(cè)樣品，并且隨時(shí)檢查儲(chǔ)存檢測(cè)樣品的空間，避免檢測(cè)樣品受到污染。
無(wú)菌操作的重要性
所謂無(wú)菌，指的是不存在保證生命活動(dòng)的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的狀態(tài)。而無(wú)菌操作則是采用無(wú)菌的器械進(jìn)行操作，防止微生物進(jìn)入無(wú)菌范圍的技術(shù)。在微生物檢驗(yàn)中，無(wú)菌操作是重要的理念，只有采用無(wú)菌操作技術(shù)，保持樣本在檢驗(yàn)過(guò)程中不受到二次污染，才能保證檢驗(yàn)結(jié)準(zhǔn)確的反映出樣本的衛(wèi)生狀況。
在檢驗(yàn)的各個(gè)環(huán)節(jié)，都有可能有微生物的進(jìn)入，因此無(wú)菌操作技術(shù)應(yīng)貫穿整個(gè)檢驗(yàn)過(guò)程，如果有一個(gè)環(huán)節(jié)沒(méi)有采用無(wú)菌操作，那么其他環(huán)節(jié)的無(wú)菌操作也將沒(méi)有任何意義。
無(wú)菌操作的具體應(yīng)用
1、取樣
微生物檢驗(yàn)首先是從樣本中無(wú)菌稱取要求檢驗(yàn)的質(zhì)量，取樣過(guò)程中使用的天平要經(jīng)過(guò)消毒，檢驗(yàn)用品如剪刀、藥匙要經(jīng)過(guò)170℃/2h 干熱滅菌。取樣過(guò)程嚴(yán)格按照無(wú)菌操作進(jìn)行，才能保證樣品的原始狀態(tài)。
前處理
根據(jù)國(guó)標(biāo)要求，取樣后要對(duì)樣品進(jìn)行前處理。一般而言，稱取 25g/ml 樣品于盛有225ml無(wú)菌稀釋液的無(wú)菌均質(zhì)袋中均質(zhì)，制備成1:10樣品勻液進(jìn)行檢驗(yàn)。對(duì)于計(jì)數(shù)樣品要，制備10倍系列稀釋樣品勻液，操作方法參見(jiàn)GB4789.2-2016。整個(gè)過(guò)程必須嚴(yán)格按照無(wú)菌操作進(jìn)行。
3、純種分離
在微生物檢查過(guò)程中，為了更加準(zhǔn)確的確定微生物群體，需要將疑似的目標(biāo)菌從混雜的樣品中分離出來(lái)，進(jìn)而得到純培養(yǎng)物。
通常情況下，需要結(jié)合不同微生物的具體特性，針對(duì)性的選擇培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件，促進(jìn)目標(biāo)微生物的繁殖。或者通過(guò)使用某種抑制素，抑制除目標(biāo)菌以外的雜菌生長(zhǎng)，進(jìn)而將其他雜菌淘汰。接著將培養(yǎng)物接種在固體培養(yǎng)基上形成目標(biāo)菌的單菌落。這種單菌落還需要進(jìn)行一定的純化與鑒定，才能保障分離的菌株為純菌株。
在整個(gè)分離純化過(guò)程中，通常需要用接種環(huán)把微生物的純培養(yǎng)物從一個(gè)器皿轉(zhuǎn)接到另一個(gè)器皿中培養(yǎng)。在這一過(guò)程中，如果不能?chē)?yán)格按照無(wú)菌操作進(jìn)行，很難保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)加強(qiáng)自身實(shí)驗(yàn)水平與操作能力，確保無(wú)菌操作技術(shù)熟練、準(zhǔn)確。
4、革蘭氏染色
革蘭氏染色技術(shù)是微生物確認(rèn)鑒定中重要的方法，將疑似的目標(biāo)菌經(jīng)過(guò)純化分離后染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察微生物形態(tài)，能初步鑒定微生物是否是所檢驗(yàn)的目標(biāo)菌。革蘭氏染色的操作步驟：涂片—初染—媒染—脫色—復(fù)染，整個(gè)過(guò)程中最重要的是涂片，涂片過(guò)程中必須嚴(yán)格無(wú)菌操作，避免雜菌混入，影響鏡檢結(jié)果。
5、空白對(duì)照
根據(jù)《GB4789.2-2016 安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》，將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1mL空白稀釋液滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)作空白對(duì)照。空白對(duì)照的結(jié)果可以說(shuō)明三個(gè)問(wèn)題：
① 檢驗(yàn)過(guò)程中所使用的檢驗(yàn)用品滅菌是否*；
② 無(wú)菌室的空氣條件是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)；
③ 操作人員的無(wú)菌操作技術(shù)是否規(guī)范。
通過(guò)空白對(duì)照的結(jié)果可直接檢驗(yàn)出實(shí)驗(yàn)器皿、實(shí)驗(yàn)條件以及實(shí)驗(yàn)人員的操作是否達(dá)到無(wú)菌操作的要求。只有空白對(duì)照結(jié)果符合要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果才是有效的。
操作人員在進(jìn)行微生物檢驗(yàn)時(shí)，一定要樹(shù)立無(wú)菌操作觀念，規(guī)范無(wú)菌操作程序，才能保證檢驗(yàn)流程順利完成。同時(shí)，操作人員要根據(jù)實(shí)際需要，合理運(yùn)用無(wú)菌操作技術(shù)，避免在微生物檢驗(yàn)中，引入雜菌，影響檢驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性、準(zhǔn)確性。
