實(shí)驗(yàn)方法原理
磷酸化位點(diǎn)的確定也使用一些通用方法；磷酸化蛋白質(zhì)被純化，如果可能蛋白質(zhì)要均一；磷蛋白被特異性的化學(xué)或酶反應(yīng)切斷、產(chǎn)生肽混合物，其中含有一到兩個磷酸肽不同之處在干其分離磷酸肽的策略是為了確定氨基酸序列，定位肽段內(nèi)磷酸化的殘基。上面所述的分離方法， 2D-PP 作圖、 HPLC 或 lMAC 方法，也同樣適宜于微量制備磷酸肽用于確定磷酸化位點(diǎn)。
實(shí)驗(yàn)材料 蛋白樣品
實(shí)驗(yàn)步驟
過去確定磷酸化位點(diǎn)測序最/常用的是逐步化學(xué)降解法，如絲/氨酸和蘇/氨酸磷酸化分析方法、酪/氨酸磷酸化分析方法, 最近，此方法已經(jīng)主要被質(zhì)譜方法所取代 。非放射活性和放射活性磷酸肽測序的方法，這兩種方法可以補(bǔ)充．在某些情況下可以替代質(zhì)譜方法來確定磷酸化位點(diǎn)。非放射活性方法是用于檢測磷酸絲/氨酸和磷酸蘇氨胺，包括β-消除，與巰基乙醇反應(yīng)形成s- 乙基化半胱氨/酸或β-甲基-s-乙基半胱/氨酸，它們很容易以 PTH 衍生物的形式從自動測序儀中提取出來。放射活性方法是由 Ceerenkov 計(jì)數(shù)檢測器檢測在 Edman 化學(xué)降解測序僻環(huán)中釋放出的放射性活度。
如果測絲/氨酸或蘇/氨酸磷酸鹽殘基，磷酸鹽被除去，可觀察到32p-磷酸鹽和各自的 PTH衍生物。在酪/氨酸磷酸鹽情況下，磷酸酯鍵更穩(wěn)定，分析的提取物是 PTH 磷酸酪/氨酸。如果得到的磷酸肽的量非常有限，也許不可能用化學(xué)降解法測肽序列，但是在降解循環(huán)后，放射活性從肽中釋放，通常有可能確定肽內(nèi)磷酸化位點(diǎn)。
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