大家在養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)候，想必大家也一定遇到過細(xì)胞狀態(tài)差這種情況，但是細(xì)胞狀態(tài)差，有很多種原因造成。細(xì)胞狀態(tài)很差，常常出現(xiàn)的現(xiàn)象是：細(xì)胞邊緣不清晰、細(xì)胞不飽滿、折光性差、背景比較臟、黑點(diǎn)很多、細(xì)胞碎片多（細(xì)胞凋亡后的細(xì)胞碎片）、單個(gè)細(xì)胞內(nèi)有空泡（凋亡）且空泡比較多；如果細(xì)胞出現(xiàn)老化，也就是細(xì)胞比較扁平、增殖減緩、細(xì)胞核體積增大、細(xì)胞突觸變多，此時(shí)觀察到的細(xì)胞狀態(tài)也是不正常的。所以，除了考慮血清和細(xì)菌污染的問題，細(xì)胞老化也不容忽視~
何為細(xì)胞老化？
1882年，德國(guó)生物學(xué)家Weismann曾大膽預(yù)測(cè)“在細(xì)胞水平存在老化現(xiàn)象"。他推測(cè)：機(jī)體的壽命限制受控于體細(xì)胞的分裂能力；在遺傳進(jìn)化中，不同物種的體細(xì)胞獲得了不同分裂的潛能，從而決定了不同物種的壽命長(zhǎng)短。
20世紀(jì)50年代，Swin和他的同事利用原代細(xì)胞體外培養(yǎng)試驗(yàn)證明了來源于不同物種的纖維細(xì)胞均不具備無限分裂的潛能。取得突破性進(jìn)展的還是Hayflflick和Moorhead，他們做了更系統(tǒng)更細(xì)致的觀察和描述，他們對(duì)25株人成纖維細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，在這個(gè)過程中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過約50次傳代之后，所有細(xì)胞出現(xiàn)功能退化，并且喪失分裂能力的現(xiàn)象。此后人們將這一現(xiàn)象稱之為“Hayflflick極限"或者自發(fā)性老化。之后也有事實(shí)證明，細(xì)胞老化并不是體外培養(yǎng)所導(dǎo)致，細(xì)胞在體內(nèi)也會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)，逐步走向老化。
細(xì)胞老化的征兆
細(xì)胞周期阻滯
長(zhǎng)期的細(xì)胞周期阻滯是老化細(xì)胞的基本特征，也是體外鑒定細(xì)胞老化bu可或缺的指標(biāo)。為了檢查細(xì)胞是否躍出了細(xì)胞周期，人們通常檢測(cè)增殖指示分子Ki-67的表達(dá)豐度；或者通過將與胸腺嘧啶相似的溴脫氧尿mi啶（Bromodeoxyuridine，BrdU）摻入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，觀察是否有新的DNA合成。細(xì)胞老化主要表現(xiàn)為G1期阻滯，個(gè)別情況下也可伴隨G2/M期周期阻滯，或直接由G2/M期阻滯誘發(fā)形成。
細(xì)胞形態(tài)改變
雖然由于細(xì)胞周期的中斷和DNA復(fù)制的停止，老化細(xì)胞內(nèi)的DNA含量與正常細(xì)胞類似，但 RNA與蛋白質(zhì)豐度均比正常細(xì)胞要明顯升高。這是因?yàn)椋M管細(xì)胞進(jìn)入老化階段后蛋白質(zhì)的整體合成速率降低，但是蛋白質(zhì)的降解體系受到更加明顯的抑制，導(dǎo)致蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)堆積。但，由于不同組織來源的細(xì)胞，其形態(tài)本就各不相同，因此，目前還并無客觀的、統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)從細(xì)胞形態(tài)判斷并定義老化細(xì)胞。換句話說，目前并不能直接根據(jù)細(xì)胞的形態(tài)去判斷是否老化細(xì)胞。
無論是原代細(xì)胞或是細(xì)胞株，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞老化現(xiàn)象是存在且常見的，但卻容易被操作人員忽略，老化的細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)的特征包括：細(xì)胞增殖變慢、細(xì)胞核體積異常及多核（4-8核）、表面分泌物增多、細(xì)胞體積增大、細(xì)胞扁平、細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡等現(xiàn)象。
總結(jié)
研究表明,衰老細(xì)胞的細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜等均有明顯的變化：
①細(xì)胞內(nèi)水分減少,體積變小,新陳代謝速度減慢；
②細(xì)胞內(nèi)酶的活性降低；
③細(xì)胞內(nèi)的色素會(huì)積累；
④細(xì)胞內(nèi)呼吸速度減慢,細(xì)胞核體積增大,核膜內(nèi)折,染色質(zhì)收縮,顏色加深.線粒體數(shù)量減少,體積增大；
⑤細(xì)胞膜通透性功能改變,使物質(zhì)運(yùn)輸功能降低.
形態(tài)變化
總體來說老化細(xì)胞的各種結(jié)構(gòu)呈退行性變化.衰老細(xì)胞的形態(tài)變化表現(xiàn)有：
1、核：增大、染色深、核內(nèi)有包含物
2、染色質(zhì)：凝聚、固縮、碎裂、溶解
3、質(zhì)膜：粘度增加、流動(dòng)性降低
4、細(xì)胞質(zhì)：色素積聚、空泡形成
5、線粒體：數(shù)目減少、體積增大
6、高爾基體：碎裂
7、尼氏體：消失
8、包含物：糖原減少、脂肪積聚
9、核膜：內(nèi)陷
分子水平的變化
1、DNA：從總體上DNA復(fù)制與轉(zhuǎn)錄在細(xì)胞衰老時(shí)均受抑制,但也有個(gè)別基因會(huì)異常激活,端粒DNA丟失,線粒體DNA特異性缺失,DNA氧化、斷裂、缺失和交聯(lián),甲基化程度降低.
2、 RNA：mRNA和tRNA含量降低.
3、蛋白質(zhì)：含成下降,細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化、氨甲酰化、脫氨基等修飾反應(yīng),導(dǎo)致蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、抗原性,可消化性下降,自由基使蛋白質(zhì)肽斷裂,交聯(lián)而變性.氨基酸由左旋變?yōu)橛倚?
4、 酶分子：活性中心被氧化,金屬離子Ca2+、Zn2+、Mg2+、Fe2+等丟失,酶分子的二級(jí)結(jié)構(gòu),溶解度,等電點(diǎn)發(fā)生改變,總的效應(yīng)是酶失活.
5、脂類：不飽和脂肪酸被氧化,引起膜脂之間或與脂蛋白之間交聯(lián),膜的流動(dòng)性降低。
那我們?cè)撊绾畏乐辜?xì)胞老化？
1. 不要等細(xì)胞長(zhǎng)得太滿才傳代。細(xì)胞太密會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)下降，產(chǎn)生細(xì)胞接觸性抑制。
2. 細(xì)胞不要消化過度。采用yi蛋白酶消化細(xì)胞，會(huì)造成細(xì)胞表面一定程度的細(xì)胞損傷。
3. 最重要的是使用優(yōu)質(zhì)的血清和培養(yǎng)基：干細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基中的內(nèi)毒素非常敏感。除了要留意基礎(chǔ)培養(yǎng)基的內(nèi)毒素外，也要留意血清的內(nèi)毒素。如果血清中內(nèi)毒素≥3EU/ml時(shí)，干細(xì)胞很容易老化或死亡，導(dǎo)致細(xì)胞“亞健康"狀態(tài)，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)受到影響。很多使用者，在血清在試用前，就會(huì)通過提早審核該批次《檢測(cè)報(bào)告》，以決定是否入圍進(jìn)行試用。
4. 在開始養(yǎng)細(xì)胞并傳代時(shí)，也要特別注意凍存細(xì)胞，以保持細(xì)胞有種子庫(kù)存在，可以有效避免細(xì)胞損傷。
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