一、真菌DNA的提取(方法一)
1.實(shí)驗(yàn)試劑
(1)DNA提取液:0.2M Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,0.01M EDTA,1％SDS
(2)3M NaAc
(3)TE:10 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1 mmol/L EDTA
(4)酚(pH8.0):氯仿:異戊醇(25:24:1)
(5)氯仿:異戊醇(24:1)
(6)異丙醇
(7)無(wú)水乙醇
(8)75%乙醇
(9)RNaseA
2.實(shí)驗(yàn)步驟
(1)取真菌菌絲0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉
(2)加入4mL提取液,快速振蕩混勻
(3)加入等體積的4mL的氯仿:異戊醇(24:1),渦旋3～5min(此處是粗提沒有加酚,可以節(jié)約成本)
(4)1000rpm,4℃,5min
(5)上清用氯仿:異戊醇(24:1)再抽提一次(10,000rpm,4℃離心5min)
(6)取上清,加入2/3倍體積的-20℃預(yù)冷異丙醇或2.5倍體積的無(wú)水乙醇沉淀, 混勻, 靜置約30 min
(7)用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀,用75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次,再用無(wú)水乙醇漂洗1次,吹干,重懸于500ul TE中
(8)加入1ul RNaseA (10mg/mL),37℃處理1h
(9)用酚(pH8.0):氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃離心5min)
(10)取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V體積的無(wú)水乙醇,-70℃沉淀30min以上
(11)沉淀用75%乙醇漂洗,風(fēng)干,溶于200ul TE中,-20℃保存?zhèn)溆?br/>
二、真菌DNA的提取(方法二)
1.真菌菌絲0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉
2.加入3mL 65℃預(yù)熱的DNA提取緩沖液,快速振蕩混勻65℃水浴30min,期間混勻2-3次
3.加入1mL 5M KAc,冰浴20min
4.氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃離心5min)
5.取上清,加入2/3倍體積的-20℃預(yù)冷異丙醇,混勻,靜置約30 min
6.用毛細(xì)玻棒挑出絮狀沉淀,用75%乙醇反復(fù)漂洗數(shù)次,再用無(wú)水乙醇漂洗1次,吹干,重懸于500ul TE中
7.加入1ul RNaseA(10mg/mL),37℃處理1h
8.用酚(pH8.0):氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃離心5min)
9.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V體積的無(wú)水乙醇,-70℃沉淀30min以上
10.沉淀用75%乙醇漂洗,風(fēng)干,溶于200ul TE中,-20℃保存?zhèn)溆?br/>DNA提取緩沖液:100mM Tris-HCl(pH8.0),20mM EDTA(pH8.0),1.5M NaCl,2% CTAB(W/V),4% PVP40(W/V)和2%巰基乙醇(V/V),PVP和巰基乙醇使用前加入5M KAc
方法一和二,是大同小異.主要是DNA提取液配方不一樣！成本也不一樣！
三、真菌菌絲的總RNA的提取
1.實(shí)驗(yàn)試劑
(1)RNA提取緩沖液(CTAB):2% CTAB(W/V),2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP(W/V),100mM Tris-HCl(pH8.0,DEPC處理的水配置),25mM EDTA,0.5g/L 亞精胺Spermidine,2.0M NaCl,2%巰基乙醇(V/V,使用前加入).由于在高溫滅菌條件下,Tris-HCl要和DEPC發(fā)生反應(yīng),所以配RNA提取緩沖液時(shí)直接用DEPC 處理的水配制即可
(2)SSTE:1 M NaCl,0.5% SDS(W/V),10mM Tris-HCl pH8.0,1.0mM EDTA
(3)10M LiCl 直接用蒸餾水配10M LiCl,加1‰的DEPC過(guò)夜后,高溫滅菌
(4)3M NaAc
(5)氯仿:異戊醇(24:1)
(6)酚(pH4.5):氯仿:異戊醇(25:24:1)
(7)DEPC處理水 用1‰的DEPC處理蒸餾水過(guò)夜,高溫滅菌
(8)無(wú)水乙醇;70%酒精
2.實(shí)驗(yàn)步驟
(1)實(shí)驗(yàn)開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預(yù)熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養(yǎng)獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養(yǎng)就更好說(shuō)了),在液氮中迅速磨成精細(xì)粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預(yù)熱的RNA提取液,顛倒混勻
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5):氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過(guò)夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提兩次,氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無(wú)水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)掃描檢測(cè)RNA的質(zhì)量
(在抽提過(guò)程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù))
注意：提取RNA請(qǐng)盡量在低溫下操作,如果條件不容許,在室溫下操作的時(shí)間要盡可能的短.
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