質(zhì)粒提取主要有堿裂解法，煮沸裂解法，小量一步提取法等。
1、堿裂解法原理：根據(jù)共價(jià)閉合環(huán)狀DNA與線性DNA的拓?fù)鋵W(xué)
結(jié)構(gòu)差異來分離的。在強(qiáng)堿環(huán)境下，細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜被破壞，基因組DNA和質(zhì)粒DNA被釋放出來，線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞而發(fā)生變性。雖然在強(qiáng)堿的條件下共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA也會(huì)發(fā)生變性，但兩條互補(bǔ)鏈仍會(huì)互相盤繞，并緊密的結(jié)合在一起。當(dāng)加入pH4.8的乙醋suan鉀高鹽緩沖液使pH恢復(fù)中性時(shí)，共價(jià)閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復(fù)性快，而線性的染色體DNA復(fù)性緩慢，細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會(huì)相互纏繞成大型復(fù)合物，后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當(dāng)用鉀離子取代鈉離子時(shí)，復(fù)合物會(huì)從溶液中有效地沉淀下來，離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNA。
2、煮沸法裂解：將細(xì)菌懸浮于含Triton X-100
和能消化細(xì)胞壁的溶jun酶緩沖液中，然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細(xì)胞壁外，還有助于解開DNA鏈的堿基配對，并使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性。但是，閉環(huán)質(zhì)粒DNA彼此不會(huì)分離，這是因?yàn)樗麄兊牧姿岫ス羌芫哂谢ハ嗬p繞的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，當(dāng)溫度下降后，閉環(huán)DNA的堿基又各自就位，形成超螺旋分子，離心除去變性的染色體核蛋白質(zhì)，就可從上清中回收質(zhì)粒DNA。
煮沸裂解法
對于小于15kb的小質(zhì)粒很有效，可用于提取步至lmL（小量制備），多至250mL（大量制備）菌液的質(zhì)粒，并且對大多數(shù)的大腸桿菌菌株都適用。
3、小量一步提取法：由于細(xì)菌染色體DNA
比質(zhì)粒大得多,受機(jī)械力后細(xì)菌染色體DNA會(huì)被震斷成不同大小的線性片段而纏繞附著在細(xì)胞碎片上，并發(fā)生變性。同樣受機(jī)械力質(zhì)粒DNA會(huì)變性，機(jī)械力消失后復(fù)性。但質(zhì)粒DNA的復(fù)性快，仍溶于溶液而細(xì)菌染色體DNA復(fù)性較慢，會(huì)形成不溶的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過高速離心可以分離得到質(zhì)粒DNA 。
 |
 |
 |
