免疫熒光的原理
免疫熒光（Immunofluorescence,IF）原理免疫熒光技術是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。它是根據(jù)抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光基團，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原（或抗體）。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質和定位，以及利用定量技術（比如流式細胞儀）測定含量。
紫外光激發(fā)熒光物質放射熒光示意圖免疫熒光實驗的主要步驟包括細胞片制備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細胞片制備（通俗的說法是細胞爬片）是免疫熒光實驗的第一步，細胞片的質量對實驗的成敗至關重要，原因很簡單，如果發(fā)生細胞掉片，一切都無從談起。這一步關鍵的是玻片（SlidesorCoverslips）的處理以及細胞的活力，有人根據(jù)成功經驗總結出許多有益的細節(jié)或小竅門，非常值得借鑒。
固定和通透步驟最重要的是根據(jù)所研究抗原的性質選擇適當?shù)墓潭ǚ椒ǎ线m的固定劑和固定程序對于獲得好的實驗結果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其它方法（如ELISA或WesternBlot）中的相同步驟是類似的，最重要的區(qū)別在于免疫熒光實驗中要用到熒光抗體，因此必須謹記避光操作，此外抗體濃度的選擇可能更加關鍵。最后需要注意的是，標記好熒光的細胞片應盡早觀察，或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因標記蛋白解離或熒光減弱而影響。
用于免疫熒光染色的染料需具備以下幾個條件：
熒光染料應有較高的量子產額和消光系數(shù)；
熒光染料對488nm的激發(fā)光波長有較強的吸收；
發(fā)射光波長與激發(fā)光波長之間應有較大的波長差；
容易與被標記的單克隆抗體結合而不影響抗體自身的特異性。
1.異硫氰酸熒光素（FITC）：可產生亮綠色熒光。FITC是免疫熒光標記最chang用的熒光探針。
2.德州紅：與生wu素偶聯(lián)的抗體有很強的親和力，產生紅色熒光。
3.藻膽蛋白類：主要包括藻紅蛋白（PE）、藻青蛋白（PC）、別藻青蛋白（APC）三類。多發(fā)生橙色至紅色熒光。
4.能量傳遞復合染料
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