堿性磷酸酶標(biāo)抗體制備技術(shù)的標(biāo)記步驟
點(diǎn)擊次數(shù)：124 更新時(shí)間：2025-06-03
堿性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP），系小牛腸粘膜和大腸桿菌中提煉出來(lái)的一種磷酸酯的水解酶，由多個(gè)同功酶組成。從小牛腸粘膜提取的AP分子量為100kDa，酶作用的最適pH為9.6；從大腸桿菌中提取酶分子量為80kDa，最適pH為8.0。它的作用底物較多，常用的酶底物有對(duì)硝基本磷酸鹽（PNP）、β-甘油磷l酸鈉、磷酸萘酯等。AP主要用作雙標(biāo)記染色，研究遞質(zhì)共存及酶免疫測(cè)定。AP標(biāo)記抗體，一般采用戊二醛作交聯(lián)劑一步法，使酶和抗體蛋白的氨基分別與戊二醛的兩個(gè)醛基結(jié)合。
堿性磷酸酶標(biāo)抗體制備技術(shù)的標(biāo)記步驟
（1）取抗體（2～5mg/mL）1mL，加入AP5mg溶解。
（2）裝入透析袋，用0.01mol/L、Ph7.2PBS4℃透析18h，換液3次。
（3）加入2.5%戊二醛20uL，室溫（20℃±）放置2h。4℃0.01mol/L、pH7.2PBS透析過(guò)夜，換液3次。
（4）移入0.05mol/L、pH8.0Tris-HCl緩沖液中，4℃透析過(guò)夜，換液3次。
（5）取出標(biāo)記抗體，用含%BSA和0.02%NaN3的Tris-HCl緩沖液稀釋至4mL，即為酶標(biāo)記物原液。
（6）加入1/3量純甘油，測(cè)定工作效價(jià)后，小量（0.1mL）分裝，4℃保存（使用前以pH7.4PBS-吐溫溶液將結(jié)合物適當(dāng)稀釋）。
