ELISA實(shí)驗(yàn)常見問題
異常：白板
結(jié)果描述：顯色步驟結(jié)束后酶標(biāo)板所有孔均無顏色。陽性對照不顯色。
原因分析：試劑已過有效期，或不同試劑盒組分混用，檢查試劑的組分及批號(hào)，確認(rèn)未過期以及所有組分均屬對應(yīng)的試劑盒。
對策：不同試劑盒或不同批號(hào)的試劑不能混用。
整板的黃板現(xiàn)象可能是由于錯(cuò)加其他試劑造成，如同時(shí)操作兩對半試劑時(shí)，測HbsAb板用于測HBsAg等；實(shí)驗(yàn)前檢查試劑的組分及批號(hào)，確認(rèn)所有組分均屬于對應(yīng)的試劑盒。如盛標(biāo)本的試管四周常有血痂，易脫落，應(yīng)遠(yuǎn)離酶標(biāo)板。ELISA試劑盒超過有效期的產(chǎn)品可能會(huì)產(chǎn)生很弱的信號(hào)；試劑盒沒有按規(guī)定進(jìn)行留存，受高溫影響；實(shí)驗(yàn)前檢查試劑的組分及批號(hào)，確認(rèn)試劑未過期。孵育溫度應(yīng)控制在37-38℃，孵育時(shí)間嚴(yán)格按照說明書操作，保溫期內(nèi)不宜多開門，以免影響保溫。花板，一般是由于臨床標(biāo)本的收集、處理和留存方法不當(dāng)造成，放置時(shí)間（自然放置 1~2h）及離心轉(zhuǎn)（3000r/min）、離心時(shí)間（15min）應(yīng)引起注意。試劑、樣品用前未平衡至室溫從低溫冰箱中取出的試劑及樣品應(yīng)置室溫平衡，20分鐘左右。錯(cuò)加、漏加試劑底物、顯色劑 A或B 嚴(yán)格按說明書的步驟操作，加完試劑后可觀察一下液面高度是否一致，以減少漏加現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，陰陽性對照正常，質(zhì)控正常，但臨床標(biāo)本感覺顯色較弱，待測標(biāo)本中可能不含強(qiáng)陽性標(biāo)本，故結(jié)果可能是正常的，如有懷疑，可復(fù)檢標(biāo)本加入疊氮鈉作為防腐劑，酶免實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)本禁用疊氮鈉作為防腐劑，可選用 proclin、硫柳汞等其他防腐劑，陰陽性對照正常，但質(zhì)控、參考品或個(gè)別弱陽性標(biāo)本未能檢出。
不同試劑盒或不同批號(hào)的試劑不能混用酶標(biāo)對吸頭的污染以及對盛放顯色劑容器的污染都易造成黃板現(xiàn)象；避免試劑組分間的交叉污染，確保吸頭、容器的干凈，顯色劑在光照條件下放置過久，實(shí)驗(yàn)前已變藍(lán)，顯色劑A、B未使用前避光留存，孵育溫度過高或孵育時(shí)間過長；孵育溫度應(yīng)控制在 37-38℃，孵育時(shí)間嚴(yán)格按照說明書操作。標(biāo)本在一周內(nèi)使用的，可存于 2-8℃，如需長期留存，應(yīng)置于-20℃以下留存。不要將ELISA試劑盒長時(shí)間置于常溫下，按使用規(guī)定儲(chǔ)藏。出現(xiàn)隨機(jī)性的花板、跳孔現(xiàn)象 樣品離心不*，反應(yīng)孔內(nèi)發(fā)生凝血或殘留細(xì)胞成分； 充分離心， 3000rpm6分鐘以上。儀器設(shè)定不正確，濾光片不匹配，重新設(shè)定酶標(biāo)儀的參數(shù)，特別是檢查濾光片是否匹配，靈敏度過高、板底高、高背景 終止后，整板結(jié)果顯現(xiàn)均一的黃色或淡黃色；或陰陽性對照、質(zhì)控正常，標(biāo)本陰性標(biāo)本，OD值過高。特別是洗滌時(shí)每孔未注滿洗液，易造成花板黃板現(xiàn)象，嚴(yán)格按說明書要求洗板。洗板及加樣過程中，酶標(biāo)受污染失活失去催化顯色劑顯色的能力，確認(rèn)盛酶標(biāo)的容器不含酶抑制劑如疊氮鈉等，確認(rèn)配制洗液的容器已洗干凈。加樣時(shí)交叉污染； 加標(biāo)本時(shí)盡量 避免交叉污染。
